3세대 유전자 가위로 인간 배아에서 돌연변이 유전자 교정 5

2017년 8월 2일 네이처지에 발표된 김진수 교수 논문 분석 5...논문에 기술된 논고(Discussion)

요약: 인간 배아세포를 교정하다. 
기초과학연구원(IBS) 유전체교정연구단장인 김진수 교수(공동 교신저자), 오레건보건과학대(OHSU, Oregon Health & Science University)의 슈크라트 미탈리포프(Shoukhrat Mitalipov) 교수(공동 교신저자) 등, 한·미 과학자들이, (1) 대대로 유전되어 내려와 젊을 때(20-30대) 비대성 심근증(돌연사)을 일으키는, 4개의 염기 쌍이 망가져 결실된(deleted) 돌연변이 유전자인 MYBPC3를 가진 정자와, (2) 이 변이된 유전자를 자르는 3세대 유전자 가위(Cas9+crRNA)를 리보핵산단백질(RNP)로 조립해(표적 이탈을 줄이기 위해), (1)의 정자와 (2)의 RNP를 동시에 모계의 정상적인 난모세포(oocyte)에 마이크로주입(co-microinjection)하면(모자이크 현상을 피하기 위해), 교정을 위해 외부에서 주입된 인조합성(synthetic) 주형 DNA or gene 도움 없이도, 난모세포가 갖고 있는 대립유전자 염기서열을 템플릿(주형)으로 스스로 이용해서, 유전자 가위에 의해 잘린 정자 유래의 변이 유전자를 정상 염기들로 복구해(HDR이 NHEJ보다 우세하게 일어나), 그 이후 분열이 일어나 성장된 배아 58개 중 42개(72.4%)가 정상임을 확인했다. 이 배아들은 착상시키지 않고 폐기함에 따라 유전자가 정상으로 바뀐 아기가 실제로 탄생하지는 않았다. 

이 연구 결과는 2017년 8월 2일자 네이처지 온라인판에 논문을 게재했는데, 인간 배아에서의 병을 일으키는 돌연변이 유전자를 교정하는데, 효율성, 정확성, 안전성을 증빙한 것이다. 이 연구 성공으로 심장병을 포함한 1만가지가 넘는 유전질환의 대물림을 막을 수 있는 길을 열었다는 평가를 받고 있다. 

안타까운 것은 국내에서는 인간 배아 유전자를 교정하는 연구가 불법이기 때문에, 한국의 유전자 가위 기술을 미국에 보내 미국에서 교정 실험이 이루어졌으며, 실험 후의 데이터 분석은 한국에서 이루어졌고 그 결과를 미국에 보내 종합해서 논문을 발표했다는 것이다. 또한 대부분의 외신은 기술과 데이터 분석을 제공한 김진수 교수 팀보다는 슈크라트 미탈리포프 교수 팀의 성과로 보도했다는 점으로, 우리 나라 관점에서 반성하고 앞으로 나아갈 방향에 시사하는 바가 크다. 

이번 연구 내용은 차후 유전자 가위의 응용 및 활용 편에서 자세히 소개할 예정이며 유료보고서로 디자인해 출간할 예정이다. 본 보고서에서는 이번 발표된 ‘3세대 유전자 가위로 병을 일으키는 인간 배아에서의 돌연변이 유전자 교정’이란 논문을 자세히 분석해보고 나름 대로의 인사이트와 앞으로 나가야 할 방향을 제시하고자 한다. 아울러 논문분석이기 때문에 필자의 지식관점에서 오류가 있을 수도 있다는 점을 분명 알려드리는 바이다.

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[글 싣는 순서] 

1장 논문 요약, 연구방법 모색 및 비대성 심근증(HCM)을 일으키는 MYBPC3의 돌연변이를 표적
1절 논문 요약
2절 비대성 심근증(HCM)과 현재 치료 방법, 새로운 방법의 고찰
3절 우리 몸의 자연적인 DNA 복구 메커니즘(NHEJ/HDR)과 모자이크 현상
4절 정상인 난모세포와 4개의 염기 쌍이 빠진 정자의 MYBPC3 돌연변이를 표적
5절 난모세포의 대립유전자를 이용 HDR이 우세하게 복구, 정자와 CRISPR-Cas9을 난모세포에 동시에 주입해 모자이크 현상 최소화

2장 4개의 염기 쌍이 빠진(삭제된, 결실된, ΔGAGT) 이형접합적 MYBPC3를 표적
1절 HCM 성인환자의 피부이용 유도만능줄기세포들( iPSCs)에 대한 테스트
2절 RNPs로 난모세포와 정자의 수정란 배아의 교정과 HDR 효율
3절 모자이크를 제거하는 수정 전 생식세포들을 표적
4절 복구(수선, 교정)된 배아의 발달과 세포 유전학
5절 복구(수선, 교정)된 인간 배아들에서의 비-표적(표적 이탈)의 중요성

3장 논문에 기술된 Discussion

4장 인사이트와 차후 도전과제와 생명윤리법 규제완화
1절 인사이트
2절 차후 도전과제
3절 배아교정연구 규제완화와 우리나라의 도전과제


3장 논문에 기술된 논고(Discussion)

1. HDR/NHEJ – 현재까지 게놈 교정에 의해 유도된 DSBs는 오류가 발생하기 쉬운(error-prone) NHEJ를 통해 주로 해결되어 왔으며, 이러한 NHEJ 복구 방법은 주로 세포들과 유기체들에서 유전자 녹아웃(knockouts or Knock-outs)을 생성하는 데 주로 사용되어 왔다. 따라서 분명 NHEJ는 일반적으로 인델(indels)이라고 하는 DSBs 사이트에서 삽입 또는 삭제 형태로 추가적인 돌연변이를 일으키기 때문에 유전자 보정 응용 프로그램에 적합하지 않다는 것이다. 반면 대조적으로, HDR은실질적으로낮은효율로일어나지만, 특히 인간 생식세포 유전자 치료가 전망되고 계획되는 경우에는 유전자 보정(gene correction)에 반드시 필요하다.

분명히 NHEJ는 일반적으로 indels라고하는 DSB 사이트에서 삽입 또는 삭제 형태로 추가적인 돌연변이를 일으키기 때문에 NHEJ는 유전자 보정 응용 프로그램에 적합하지 않다.

2. 생식 게놈 무결성의 차별화 메커니즘 – 연구팀은 이번 연구를 통해, 인간의 생식세포들과 접합자들에서의 DSBs가 모계의 정상(WT) 대립유전자를 하나의 복구 주형으로 이용해 전적으로 복구(수선)되는, 내인성 HDR 기전(기작, 메커니즘)을 사용해 우선적으로 우세하게 일어나 해결된다는 것을 보여주고 있다. 대조적으로, iPSCs의 HDR 효율은 상당히 낮았으며, 외인성 DNA인 ssODN을 템플릿(주형)으로 이용해 주로 복구가 일어났다. 이현저한차이는, 인간의 생식세포들과 배아들은 아마도 생식 게놈 무결성(germline genome integrity)을 유지하는 진화의 중요성을 반영하는 다른 DNA 손상 반응 시스템(different DNA damage response system)을 사용한다는 것을 의미한다.

아마도 감수분열 재조합과 분리(meiotic recombination and segregation) 과정에서, 생식 세포들과 접합자들은 DSBs 수가 증가하는 것을 참고 인내한다면, 효율적인 게놈 복구 능력이 중요할 것이고, 고유의 DNA 복구 기계(machinery)는 성숙 과정에서 축적되고 저장된 모계 난모세포 인자들(factors)에 전적으로 의존하게 되는 것 같다. 왜냐하면 접합자들은 전사적으로 침묵하기(zygotes are transcriptionally silent) 때문이다. 최근의 연구에 따르면, 난모세포는 상동 재조합 메커니즘(homologous recombination mechanism)을 통해 DSBs의 수선(복구)을 조절하는 실조증-모세혈관 확장 돌연변이(ATM, an ataxia-telangiectasia mutated)-매개 DNA 손상 신호 전달(DDS, DNA damage signalling)이라는 기전을 이용할 수도 있다고 제안하고 있다(Titus, S. et al., Science Translational Medicine, 13 Feb 2013). 

따라서, CRISPR/Cas9-유도된 DNA 절단은 감수분열 재조합-유도된(meiotic recombination-induced) DSBs의 수선을 위해 예비된 기존의 자연적인(native) 난모세포 기계를 유인하는 경향이 있다. 또한 연구결과에 기초해, 이형접합적 인간 배아들에서 유전자 보정을 위한 외인성 올리고 템플레이트들(oligo template)을 제공할 필요조차 없다는 것이다.

3. 동물과 인간 배아 – CRISPR-Cas9의 효율은 유전된 형태의 백내장(cataracts)을 일으키는 Crygc 유전자에서 이형접합적 우성 돌연변이를 포함하는 마우스 연구에서 최근에 평가됐는데, 일부 HDR-수선 이벤트는 상동 염색체의 정상(WT) 대립유전자 서열을 사용했다(Wu, Y. et al., Cell Stem Cell, 5 Dec 2013). 하지만 이 연구결과는 외인성 올리고 주형을 통한 HDR의 빈번한 교정으로, 외인성 올리고에 의해 보정된 Crygc 유전자를 보유하는 3 마리의 새끼들과 정상(WT) 대립유전자에 의해 보정된 1마리의 새끼에 불과했다. 인간 이형접합적 배아들에 관한 이전의 연구에서, HDR은 정상 대립유전자-기반의 복구가 아닌, 단지 외인성 DNA 주형에 의해 전적으로 복구가 일어난 연구가 있었다(Tang, L. et al., Molecular Genetics and Genomics, Jun 2017).

이러한 결과들은 개별 할구들보다는 전체 배아들에서 나온 대량의 DNA에서 유래됐으므로, 정상(WT) 대립유전자를 통한 HDR의 사례들을 간과했을 가능성이 있다.

4. 더욱 최적화 된 HDR – 주목할만한 표적 효율과 높은 HDR 빈도에도 불구하고, 일부 CRISPR-Cas9-처리(주입)된 인간 배아들은 NHEJ에 의해 유도된 인델(indels)을 보여주고 있으므로 in vitro에의 전이(이식, transfer)에 적합하지 않다는 것이다. 따라서, 게놈 교정 접근법은 생식세포 보정의 임상 적용을 고려하기에 앞서 더욱 최적화 되어야만 한다.

이를 해결하기 위한 방편으로, 게놈 교정에서 NHEJ 메커니즘을 억제함으로써 HDR 기전(기작)을 강화시키는 변형들(Modifications)이 보고됐다(Maruyama, T. et al., Nature Biotechnology, 23 March 2015; Chu, V. T. et al., Nature Biotechnology, 24 March 2015). 다른 접근법은 세포주기(cell cycle)를 조작(manipulating)하거나 기증자 단일가닥 ssDNA Design을 변형하는데(modifying) 초점을 맞추고 있다(Lin et al., eLife, 2014; Richardson et al., Nature Biotechnology, 20 January 2016).
 
이러한 연구의 일부는 배양된 세포와 관련해 HDR 결과를 유의하게 개선했지만, 배아 유전자 보정에 대한 관련성은 아직 알려지지 않은 채로 남아있다. 또한, 인간 생식세포들 또는 배아들을 작은 분자 및/또는 억제제(inhibitors)에 보충적으로 노출시키는 것은 배아 발달에 악영향(adversely affect)을 미칠 수 있다.

5. 세포주기의 중요성 – 비인간 영장류 연구에서, 원숭이 접합자에 CRISPR-Cas9를 주입하면 정상(WT) 유전자들을 파괴할 수 있다는 결과를 보여주고 있으며, 그 결과로 자손들은 평생 돌연변이 및 돌연변이 관련 표현형(phenotypes)을 갖고 살아 갈수 있다. 쥐 및 다른 동물에서 보인 연구결과와 유사하게, 게놈-교정된 인간 이식란(preimplantation embryos) 및 신생아 원숭이들은 그들의 세포 및 조직에서 모자이크 유전자형을 보이고 있는데, 이는 DSBs 및 후속 복구(수선)가 단일 돌연변이 대립유전자 단계(at the single mutant allele stage)에서는 일어나지 않는다는 것을 시사하는 것이다. 위에서 논의한 것처럼, 유전자-교정 인간 배아들에서의 모자이크 현상은 발견하기가 어려우므로, 가능한 임상 응용에 심각한 안전 문제를 제기할 수도 있다.

Cas9 활동의 반감기(half-life)를 줄이는 것과 관련된 변형(Modifications)은 원숭이 배아에서의 모자이크 발현을 감소시켰으나 완전히 제거하지는 못했다. 반면 CRISPR-Cas9를 초기 단계 접합자에 도입하는 것은 마우스 배아에서의 모자이크을 감소시켰다(Hashimoto et al.,  Developmental Biology, Oct 2016)).

이러한 선행 연구결과를 감안할 때, 중요한 것은, 연구팀은 CRISPR-Cas9를 M-단계 난모세포로 전달해 배아 절단에서 모자이크를 없앰으로써, 유전자 표적화 및 교정 효율이 DNA 합성 및 세포주기 단계와 밀접하게 관련되어 있음을 제안한 것이다.

DSBs 수선에서 NHEJ 또는 HDR의 선택은 세포주기 단계에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 HDR은 DNA 복제가 완료되고 자매 염색분체(sister chromatids)가 복구 주형으로서 사용 가능할 때인, 늦은 S 및 G2 단계(late S and G2 phases)로 제한된다(Lin et al., eLife, 2014). 특히, HDR 메커니즘은 M 및 초기 G1 단계에서 감소되는 반면(were downregulated), NHEJ-유도 게놈 교정은 증가했다(Orthwein, A. et al., Science, 11 Apr 2014). 

그러나 연구팀은 ICSI 시기에 CRISPR-Cas9를 MII 난모세포로 전달됐을 때 조차도, 감소된 HDR 효율을 관찰하지 못했다. 한가지가능한설명은배양된세포에서의유사분열 M-단계(mitotic M phase)와 비교해 생식세포에서의 감수분열 M-단계(germ cell meiotic M phase)는 DNA 복구 반응(DNA repair response)이 다르다는 것이다. 또는 DSBs가 M 또는 G1 단계에서 일어날 수도 있으며, 반면 HDR 복구는 그 이후의 세포주기인 S 또는 G2 단계에서 수행 될 수도 있다는 것이다.

6. 비-표적(표적 이탈) 효과를 줄이기 위해 플라스미드 대신 RNP 사용 분석방법의 차별화– CRISPR-Cas9에 의해 의도된 표적 사이트를 벗어난 잠재적인 비-표적(표적 이탈) DNA 손상에 대한 광범위한 보고서가 발표됐다. 특히, 김진수 교수 팀이 밝힌 플라스미드 형질 주입 및 이후 높은 효소 농도를 통한 Cas9의 과-발현(overexpression)은 비-표적(표적 이탈) 효과를 증가시켰다(Kim et al., 2014). 

그래서 이번 인간 난모세포와 접합자에 대한 연구에서는 플라스미드 대신에 정제된 재조합 Cas9 단백질을 사용해, 효소노출시간을줄이면서특이성을높여비-표적 효과를 감소시켰다. 이것도 김진수 교수 팀이 개발한 리보핵산단백질(RNP, ribonucleoproteins)이다. RNP단백질은 DNA보다 빨리 분해되기 때문에 DNA를 자를 충분한 시간적 여유가 없어, 표적 사이트 이외의 비-표적 사이트를 자를 시간이 없으므로, 비-표적(표적 이탈) 효과를 줄일 수 있었다. 

그리고 김진수 교수 팀이 2015년 개발하고 2016년에 향상시킨 절단게놈 시퀀싱(Digenome-seq, digested genome sequencing)을 도입해 분석하고, 아울러 전체 게놈 시퀀싱(WGS, whole-genome sequencing)과 WES(whole-exome sequencing) 분석을 통해 CRISPR-Cas9가 주입된 인간 배아 또는 ES 세포의 여러 개별 할구들에서 어떠한비-표적 돌연변이도 검출되지 않았다는 것이다. 또한 WES 분석은 유전자 보정 후 게놈 안정성 유지(maintenance of genome stability)를 입증했다. 그리고 연구팀은 조사에서 CRISPR-Cas9 표적이 매우 정확해 안전 문제에 대한 확신(assurance regarding safety concerns)을 제공했다.

7. 동형접합적 돌연변이 교정은 도전 과제 – 강조되어야 할 다른 이슈로는 인간의 이형접합적 돌연변이들에 대한 유전자 보정 접근법의 적용 가능성이다. 그러나 양쪽의 대립유전자가 돌연변이이고, 그래서 정상(WT) 대립유전자-기반 HDR 메커니즘이 사용될 수 없을 때, 인간 배아에서 동형접합적 돌연변이들을 수선하는 것은 현재까지 어려우므로 하나의 도전 과제가 될 수 있다. 

나타난 바와 같이, 수정 전(착상 전) 유전진단(PGD, preimplantation genetic diagnosis)은 영향을 받은 자손을 생산할 위험이 있는 이형접합적 커플들에게는 실행 가능한 하나의 선택 일 수 있다. 부모 중 한 명만이 이형접합적 돌연변이를 가지고 있는 경우, 배아의 50 %가 돌연변이가 되어야 한다. 이 경우 표적-유전자 보정은 돌연변이 인간 배아들의 상당 부분을 구출 할 수 있어, in vitro에 옮길 수 있는 교정된 배아의 수를 증가시킨다는 것이다.

 

크기변환_사본-10632695_637493523030856_2757249799481243589_n차원용 소장/교수/MBA/공학박사/미래학자

아스팩미래기술경영연구소(주) 대표, (전)국가과학기술심의회 ICT융합전문위원회 전문위원, 국토교통부 자율주행차 융복합미래포럼 비즈니스분과 위원, 전자정부 민관협력포럼 위원, 국제미래학회 과학기술위원장