3.5세대 유전자 가위(CRISPR/Cpf1) 논문 분석 4

- 서울아산병원 및 울산의대, 녹아웃(Knockout) 마우스의 생성

요약: 생명과학자들은 최근 3세대를 넘어 보다 정확하고 표적에 특이적인 3.5세대 유전자 가위(CRISPR/Cpf1)를 발견하고 개발했다. 인간세포와 동식물세포의 유전자를 마음대로 교정하는데(Editing) 사용한다. 표적 DNA를 자른 후 세포 내 복구 시스템에 의해 다시 연결되는 과정에서 유전자 교정과 원하는 변이가 일어난다. 이 방식을 활용해 암과 AIDS 등뿐만 아니라 더 나아가 희귀난치병 치료나 작물•가축개량•미래식량(Clean meat) 분야에서 유전자 가위 혁명이 빠르게 확산되고 있다. 특정 유전자 부위를 정확하게 잘라 내 그 기능을 알아내는 데에도 사용되고, 쥐를 대상으로 특정 유전자를 제거/억제하거나(Knock-out) 특정 유전자를 삽입하여(Knock-in) 희귀 병을 가진 쥐를 만들기도 하는데, 종전에는 수 개월~수 년이 걸렸지만 유전자 가위를 이용하면 시간과 비용을 획기적으로 줄일 수 있기 때문이다. 이렇듯 인류는 세포 안에 있는 특정 유전자나 염기를 골라서 제거하거나 정상으로 바꿀 수 있는 유전자 가위 기술을 보유했다. 

본 보고서에서는 3.5세대 유전자 가위에 대한 논문 공개 순으로 내용을 살펴보고 분석해 인사이트를 제공하고자 한다. 아울러 논문분석이기 때문에 오류가 있을 수도 있다는 점을 알려드리는 바이다.

Cpf1글 싣는 순서
1장. Cpf1 발견의 과정 
2장. 펭 장 교수 팀, 새로운 CRISPR/Cpf1의 발견과 인간 세포대상 연구결과(2015) 
3장. CRISPR/Cpf1유전가 가위 전쟁(2016)
3-1. 김진수 교수 팀, 쥐의 표적 돌연변이유도와 털 색이 다른 쥐의 생성

3-2. 서울아산병원 및 울산의대, 녹아웃(Knockout) 마우스의 생성
3-3. 김진수 교수 팀, Cpf1의 정확성 입증 
3-4. 하버드대 케이스 정 박사 팀, Cpf1의 정확성 입증
4장. 네이처 바이오테크놀러지의 Cpf1의 정확도를 다트게임으로 묘사(2016)
5장. Discussion


3장. CRISPR/Cpf1유전가 가위 전쟁(2016)

2016년 8월, 유전자 교정에 대해 10년 가까이 논문을 다룬 생명과학 및 화학분야 국제학술지 ‘네이처 바이오테크놀로지(Nature biotechnology)’에는, 앞서 살펴본 펭 장 교수가 밝힌 3.5세대 CRISPR/Cpf1의 메커니즘(Zetsche et al., Cell, 25 Sep 2015)을 활용한 연구성과 3편이 실렸는데, 공교롭게도 모두 우리나라 연구팀의 연구성과였다. 기초과학연구원(IBS) 유전체교정연구단 김진수단장(서울대 화학과 교수) 연구팀의 논문이 2편, 그리고 서울아산병원 아산생명과학연구원 및 울산의대의 연구팀의 논문이 1편 등이다. 3편의 논문들 중 2편은 807~808페이지와 808~810페이지에 실린 2페이지의 논문들이고, 863~868 페이지에 실린 논문은 김진수 교수 팀의 논문이다. 이들 3편은 2016년 6월 6일에 온라인판에 공개되었던 논문들이다. 

3-2. 서울아산병원 및 울산의대, 녹아웃(Knockout) 마우스의 생성

서울아산병원 아산생명과학연구원 및 울산의대의 이상욱·이명섭·백인정·성영훈(교신저자들) 교수를 중심으로 충북대 연구팀은 “Cpf1을 활용한 녹아웃 마우스의 생성(Generation of knockout mice by Cpf1-mediated gene targeting)”(Kim et al., Nature Biotechnology, Aug 2016)이라는 논문을 발표했다. 연구팀은 Cpf1을 이용하여 쥐에서 특정 유전자의 발현을 억제하거나 제거하는, 다시 말해 유전자 절단을 통해 특정한 유전자가 영구적으로 불활성화된 생쥐를 만든 것이다. 

연구팀은 우선 쥐에서 Cpf1의 유전자-표적 가능성을 실험하기 위해, 마우스 유전자인 transformation related protein 53 (Trp53)을 엔코딩한 exon 7 내의 두 가지 표적 DNA를 선정하고, 펭 장 교수가 밝혀낸(Zetsche et al., Cell, 25 Sep 2015) AsCpf1과 LbCpf1을 사용하였다(<그림 1a>). 그리고 각각의 Cpf1 과 crRNA를 mRNA를 벡터(운반체)로 사용하여 C57BL/6J 마우스의 전핵-상태 마우스 배아들(of pronuclear-stage mouse embryos)의 세포질(cytoplasm)에 마이크로주입한 후, 살아남은 배아들을 수양모(대리모)의 난관으로(the oviduct of foster mothers) 옮겼다. 

1▲<그림 1a> Cpf1 매개 Trp53 돌연변이 쥐의 생성. 쥐 Trp53 유전자 좌위(locus) 내의 두 가지 표적 DNA 서열들이 파랑색과 빨강색으로 표시됨. 이 영역은 Trp53 단백질의 187~221개의 아미노산을 엔코딩한 Trp53 mRNA의 716~820의 nt에 상응. 왼쪽과 오른쪽의 각각의 파랑색과 빨강색의 점선 표시는 얼기 설기로 자를 잠정적 예측 위치. 파랑색으로 밑줄 친 서열은 PAM. Image: Kim et al., Nature Biotechnology, 2016

배아들은 마이크로주입 즉시 어떤 독성의 징후(any signs of toxicity)를 보이지 않았지만, 수정 직후를 말하는 태아기일(embryonic day, E)인 E12.5~E14.5일까지 살아남은 %는 11.9%~37.1%와 같이 다양했다(<표1>). 또한 <표1>에서 보는 바와 같이 두 가지 DNA 표적 중 #1 혹은 #2를 표적으로 했을 때, 쥐의 배아에서의 돌연변이유도가 7.7%~75.0%로 나타났는데, 이러한 결과는 AsCpf1과 LbCpf1이 쥐의 배아에서 돌연변이 쥐를 만들 수 있을 만큼 높은 돌연변이유도를 한다는 것을 제안하는 것이다.

그 다음 배아에서의 높은 돌연변이유도를 확인한 다음, 연구팀은 Trp53 돌연변이 쥐를 만들기 위해, 주입한 배아들 중 살아남은 배아들을 수양모(대리모)의 난관으로 옮기고(이식하고), 그 결과 새끼들을 얻었다. 예를 들어 AsCpf1의 경우 24마리 새끼들이 태어나서 주입 배아 대비 24/59=40.7%의 효율을 보였고, 24마리 중 돌연변이 쥐(mutant founders)는 19마리로 19/24=79.2%의 돌연변이 효율을 보였다. LbCpf1의 경우 18마리 중 13마리가 돌연변이로 13/18=72.2%를 보였다(<그림 1b>). 

<표1> C57BL/6J 쥐 배아에서의 AsCpf1과 LbCpf1의 뉴클레아제 활동들(Kim et al., Nature Biotechnology, 2016)

2<표1>의 설명. No. of injected zygotes는 Cpf1 mRNA를 주입한 배아들 혹은 접합자들의 수. No. of surviving and transferred(%)는 주입한 배아들 중 살아남은 배아들을 수양모의 난관에 옮겨진 수와 %. b는 E12.5~E14.5일까지 살아남은 배아 수와 %. No. of newborns는 새로 태어난 새끼들의 수. #1과 #2의 두 가지를 동시에 표적으로 했을 때 AsCpf1의 경우 24마리 새끼들이 태어나서 주입 배아 대비 24/59=40.7%의 돌연변이 효율을 보였고, 24마리 중 돌연변이 쥐는 19마리로 19/24=79.2%의 돌연변이 효율을 보임. ’-‘는 not tested. Image: Kim et al., Nature Biotechnology, 2016

3▲<그림 1b> 아가로오스 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)과 PAGE-베이스 게놈타이프 분석으로 돌연변이를 가진 쥐를 판별. 1에서 8까지의 숫자는 새로 태어난 쥐. M=a molecular size marker, WT=wild-type mouse, *=표적 절단으로 인해 인델(Indels)에 의한 돌연변이를 가지고 태어난 쥐(founder mice). Image: Kim et al., Nature Biotechnology, 2016

그 다음 돌연변이 쥐들에 대한 생거 시퀀싱 분석(Sanger sequencing analyses)을 실시한 결과 이러한 돌연변이들의 대부분은 인델(indels)이라는 것이 확인되었다(<그림 1c>). 또한 Trp53 단백질의 수준을 분석한 결과 WT 쥐의 조직에서는 발견이 되지만, 돌연변이 쥐(#13 번째 탄생 쥐)에서는 발견이 안되었는데, Trp53 유전자가 표적이 되어 절단이 되었기 때문이다. 

4▲<그림 1c> 돌연변이 쥐들에 대한 생거 시퀀싱 분석 결과 대부분의 돌연변이들은 인델임.  ‘-‘는 삭제된 염기들. ‘+’의 소문자 빨강색 염기들은 삽입된 염기들. Image: Kim et al., Nature Biotechnology, 2016

마지막으로 연구팀은 생체 내(in vivo) 유전자 표적에서 Cpf1의 특이성(specificity)을 결정하기 위해, 돌연변이 쥐에서 잠재적인 비-표적 효과(off-target effects)인 비-표적 돌연변이(off-target mutations)를 검사했다. Trp53의 표적 서열과 유사성을 갖는 마우스 게놈 내의 가능한 비-표적 사이트들이 선택되었고, AsCpf1 및 LbCpf1로 생성된 5 개의 돌연변이 쥐들로부터 채취된 게놈 DNA 샘플을 심층 시퀀싱(deep sequencing 기법에 의해 분석 하였다. 그결과표적서열 # 1과 # 2에 대해 2-4bp의 불일치(2- to 4-bp mismatches)가 있는 17 개의 잠재적인 비-표적 사이트들에서 주목할만한 비-표적 효과가 없음을 발견했다. 또한 표적서열 # 2에 1-bp 불일치가 있는 하나의 표적 사이트를 확인 하였지만, 그 사이트에서의 돌연변이 빈도수는 18.6 % (AsCpf1) 및 16.3 % (LbCpf1)였다. 

이러한 결과는 AsCpf1-crRNA 복합체와 LbCpf1-crRNA 복합체가 Cas9-short guide RNA(sgRNA) 복합체의 결과와 비교할 때 최소한의 비-표적 효과(minimal off-target effects)를 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다. 그리고 이러한 미비한 비-표적 효과는 주의 깊게 표적 서열을 선택함으로써 사전에 회피될 수 있다. 

 

크기변환_사본-10632695_637493523030856_2757249799481243589_n차원용 소장/교수/MBA/공학박사/미래학자

아스팩미래기술경영연구소(주) 대표, (전)국가과학기술심의회 ICT융합전문위원회 전문위원, 국토교통부 자율주행차 융복합미래포럼 비즈니스분과 위원, 전자정부 민관협력포럼 위원, 국제미래학회 과학기술위원장

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