3.5세대 유전자 가위(CRISPR/Cpf1) 논문 분석 3

- CRISPR/Cpf1유전가 가위 전쟁(2016), 김진수 교수 팀, 쥐 표적 돌연변이 유도와 털색이 다른 쥐 생성

요약: 생명과학자들은 최근 3세대를 넘어 보다 정확하고 표적에 특이적인 3.5세대 유전자 가위(CRISPR/Cpf1)를 발견하고 개발했다. 인간세포와 동식물세포의 유전자를 마음대로 교정하는데(Editing) 사용한다. 표적 DNA를 자른 후 세포 내 복구 시스템에 의해 다시 연결되는 과정에서 유전자 교정과 원하는 변이가 일어난다. 이 방식을 활용해 암과 AIDS 등뿐만 아니라 더 나아가 희귀난치병 치료나 작물•가축개량•미래식량(Clean meat) 분야에서 유전자 가위 혁명이 빠르게 확산되고 있다. 특정 유전자 부위를 정확하게 잘라 내 그 기능을 알아내는 데에도 사용되고, 쥐를 대상으로 특정 유전자를 제거/억제하거나(Knock-out) 특정 유전자를 삽입하여(Knock-in) 희귀 병을 가진 쥐를 만들기도 하는데, 종전에는 수 개월~수 년이 걸렸지만 유전자 가위를 이용하면 시간과 비용을 획기적으로 줄일 수 있기 때문이다. 이렇듯 인류는 세포 안에 있는 특정 유전자나 염기를 골라서 제거하거나 정상으로 바꿀 수 있는 유전자 가위 기술을 보유했다. 

본 보고서에서는 3.5세대 유전자 가위에 대한 논문 공개 순으로 내용을 살펴보고 분석해 인사이트를 제공하고자 한다. 아울러 논문분석이기 때문에 오류가 있을 수도 있다는 점을 알려드리는 바이다.

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▲기초과학연구원(IBS) 유전체교정 연구단장이자 서울대 화학부 김진수 교수. (출처: 아산사회복지재단)
글 싣는 순서

1장. Cpf1 발견의 과정 
2장. 펭 장 교수 팀, 새로운 CRISPR/Cpf1의 발견과 인간 세포대상 연구결과(2015) 

3장. CRISPR/Cpf1유전가 가위 전쟁(2016)
3-1. 김진수 교수 팀, 쥐의 표적 돌연변이유도와 털 색이 다른 쥐의 생성

3-2. 서울아산병원 및 울산의대, 녹아웃(Knockout) 마우스의 생성
3-3. 김진수 교수 팀, Cpf1의 정확성 입증 
3-4. 하버드대 케이스 정 박사 팀, Cpf1의 정확성 입증
4장. 네이처 바이오테크놀러지의 Cpf1의 정확도를 다트게임으로 묘사(2016)
5장. Discussion


3장. CRISPR/Cpf1유전가 가위 전쟁(2016)

2016년 8월, 유전자 교정에 대해 10년 가까이 논문을 다룬 생명과학 및 화학분야 국제학술지 ‘네이처 바이오테크놀로지(Nature biotechnology)’에는, 앞서 살펴본 펭 장 교수가 밝힌 3.5세대 CRISPR/Cpf1의 메커니즘(Zetsche et al., Cell, 25 Sep 2015)을 활용한 연구성과 3편이 실렸는데, 공교롭게도 모두 우리나라 연구팀의 연구 성과였다. 기초과학연구원(IBS) 유전체교정연구단 김진수 단장(서울대 화학과 교수) 연구팀의 논문이 2편, 그리고 서울아산병원 아산생명과학연구원 및 울산의대의 연구팀의 논문이 1편 등이다. 3편의 논문들 중 2편은 807~808페이지와 808~810페이지에 실린 2페이지의 논문들이고, 863~868 페이지에 실린 논문은 김진수 교수 팀의 논문이다. 이들 3편은 2016년 6월 6일에 온라인 판에 공개되었던 논문들이다. 

3-1. 김진수 교수 팀, 쥐의 표적 돌연변이유도와 털 색이 다른 쥐의 생성 

우선 첫째 논문은 기초과학연구원(IBS) 유전체교정연구단 김진수 단장(서울대 화학과 교수, 교신저자)을 중심으로 과학기술연합대학원대학교와 고려대의대 및 툴젠(ToolGen)의 연구팀이 발표한 “Cpf1 리보핵산단백질들(RNPs)을 전기충격 혹은 전기천공법으로 쥐에 주입하여 표적 돌연변이유도(Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins)”(Hur et al., Nature Biotechnology, Aug 2016)라는 논문이다. 

논문의 핵심은 펭 장교수가 Cpf1의 메커니즘을 밝혀냈지만(Zetsche et al., Cell, 25 Sep 2015), 동물 또는 식물에서 표적 돌연변이유발(유도)에 대한 Cpf1의 잠재력은 입증되지 않았는데 이를 쥐를 통해 입증했다는 것이고, 장 교수의 형질주입(transgenic) 방법은 유전자를 엔코딩한 플라스미드 DNA 형태로 주입했고 다른 연구자들은 mRNA로 주입했었는데 – 이를 마이크로주입(microinjection, 미세주입, 미량주사, 현미주사)이라 함 – CRISPR와 Cpf1을 재조합 해서 리보핵산단백질(RNP, ribonucleoprotein)을 조립해 이를 전기천공법으로 직접 주입해서(Direct Injection) 표적의 정확도를 더 높여 표적에서만 일어나는 돌연변이 마우스의 생성을 보고했다는 내용이다. 

김진수 교수 연구팀은 그 전에 돌연변이유발(유도) 시 플라스미드 DNA 형태가 아니라 RNP 형태로 주입하면 더 표적 정확도를 높이고 비-표적 확률은 낮출 수 있다는 것을 증명했는데, 2013년에 Cas9-sgRNA를 재조합 한 RNP를 C-엘레강스에 집적 주입해서 유전자를 높은 정확도로 제거/억제시켰으며(Knock-out)(Cho et al., 2013), 2014년에는 Cas9 RNP를 인간 세포에 직접 주입해 고효율의 게놈 수정을 보고한바 있다(Kim et al., 2014).

Cas9RNP단백질은 DNA보다 빨리 분해되기 때문에 DNA를 자를 충분한 시간적 여유가 없어, 표적 사이트 이외의 비-표적 사이트를 자를 시간이 없으므로, 비-표적(표적 이탈) 효과를 줄일 수 있다, 따라서 이번에 그 전의 연구결과인 Cas9 RNP를 바탕으로 Cpf1과 crRNA를 RNP 형태로 사용하여, 세포 내에 들어 있는 단백분해효소(endogenous protease)나 RNA 분해효소(RNase)에 의해서 신속히 분해가 가능해져, 비-표적(off-target) 확률을 낮춘 것이다. 결국 Cpf1의 정확도를 증빙했을 뿐만 아니라 Cpf1을  RNP의 형태로 사용하게 될 경우 표적 사이트에서만의 정확한 돌연변이를 유도할 수 있다는 새로운 메커니즘을 밝혀낸 것이다.

1▲<그림 S1b> 표적 심층 서열 분석(Targeted deep sequencing assay). FoxN1 유전자를 표적으로 하는 AsCpf1 단백질과 하나 혹은 둘의 crRNAs로 재조합 된 AsCpf1 RNP가 전기천공으로 NIH3T3 cells에 주입되어 절단 실험. 가운데 그래프의 인델 수치가 가장 적고 많게는 45%까지의 돌연변이유도. Image: Hur et al., Nature Biotechnology, 2016   

우선 대장균에서 AsCpf1을 발현시키고 Cpf1 단백질을 정제한 후, Cpf1의 활동을 in vitro와 배양된 마우스 NIH3T3 cells에서 테스트했다. 그 다음 조립된 Cpf1 RNPs로 표적 DNA 절단을 in vitro에서 실험한 결과 절단 효율이 높았으며, 배양된 NIH3T3 cells에서는 Forkhead box protein N1을 엔코딩한 Foxn1 유전자 표적 사이트에서 빈도수 45%에 이르는 인델(Indels), 즉 돌연변이가 유도되었다(<그림 S1b>, <그림 1a>). 

2▲<그림 1a> Foxn1 exon 7에 있는 서열들을 표적으로 하는 두 개의 CRISPR RNAs(crRNAs). Image: Hur et al., Nature Biotechnology, 2016

In vitro와 배양된 세포에서 Cpf1 RNP가 잘 작동하고 있다는 것을 확인한 연구팀은 이제 마우스 배아(mouse embryos)에서 실험을 했다. 우선 AsCpf1 RNPs들을 마이크로주입을 통해 36개의 세포 상태의 배아들(one-cell-stage embryos)에 주입하고(<그림 S2a>) in vitro에서 배양을 해서 12개의 배반포들(blastocysts)을 얻었다. 

3▲<그림 S2a> 마이크로주입을 통해 AsCpf1 RNPs들을 36개의 세포 상태의 배아들(one-cell-stage embryos)에 주입하는 개략도. Image: Hur et al., Nature Biotechnology, 2016

T7 엔도뉴클레아제1(T7E1) 분석과 표적심층 서열 분석(Targeted deep sequencing assay)을 통해 12개의 배반포들에서 10개가(83%) Cpf1이 매개한 Foxn1 에서 돌연변이를 일으켰다(<그림 S2b>).

4▲<그림 S2b> 표적 사이트에서 돌연변이를 분석하는 T7 엔도뉴클레아제1(T7E1) 분석과 표적 심층 서열 분석(Targeted deep sequencing assay). *는 분석을 통한 돌연변이 검출을 나타냄. Image: Hur et al., Nature Biotechnology, 2016.

똑 같은 표적 사이트에 대한 SpCas9 RNPS를 적용하여 실험한 결과 같은 수준의 돌연변이 효율(90%)을 보였다. 또한 T7E1 분석과 표적 심층 서열 분석을 통해 4-nt까지의 불일치(4-nucleotide mismatches)를 가진 상동 사이트들(homologous sites)에서 비-표적 돌연변이가 검출되지 않았다. 이것은 무엇을 의미하는가 하면 Cpf1 RNPs가 매우 높은 특이적(highly specific)이라는 것을 제안하는 것이다. 

그 다음 연구는 Cas9 RNPs와 Cpf1 RNPs가 동물의 배아에 마이크로주입 대신 전기천공법(electroporation)으로 주입될 수 있는지를 실험했다. 왜냐하면마이크로주입이동물의형질주입이나동물의특정유전자억제(gene knockout)에 많이 사용화는 방법이지만, 기술적으로 단일-세포 배아에 주입하는 것은 상당히 어렵고, 집중적인 교육을 받아야 하며, 따라서 시간이 많이 걸리는 노동집약적(labor-intensive)이기 때문이다. 훈련을 받은 전문가들도 하루에 다룰 수 있는 배아의 수가 수백 개에 불과하다. 따라서 전기천공을 사용하면 RNP를 단 5분 안에 동시에 50개의 배아에 주입할 수 있다.

연구팀은 마우스 게놈의 Vegfa 또는 Foxn1 유전자 좌위(locus)를 표적으로 하는 SpCas9 RNPs를 50 개의 배아에 전기천공으로 주입하고 그 다음 배반포들로 배양했다. 그 결과 15개의 배반포들 중 12개(80%), 11개 중 11개(100%)가 Vegfa 또는 Foxn1 표적 사이트에서 돌연변이가 유도되었다(<그림 S5a>). 이것은 전기천공 방법이 Cas9 RNPs을 동물 배아에 주입하는 가장 효율적인 방법임을 제안하는 것이다.

5▲<그림 S5a> 전기천공으로 SpCas9 RNPs를 주입한 15개의 배반포들 중 12개(80%), 11개 중 11개(100%)가 Vegfa 표적 사이트에서 돌연변이가 유도됨. Image: Hur et al., Nature Biotechnology, 2016

이번에는 Foxn1 exon 7를 표적으로 하는 AsCpf1 RNPs를 마우스의 배아에 천기천공으로 주입했다(<그림 1b>). 그 결과 25개의 배반포들 중 16개(64%)가 표적 사이트에서 돌연변이가 유도되었다(<그림 1c>). 이러한 연구 결과는 Cas9 RNP와 Cpf1 RNP가 전기천공으로 동물 배아에 주입될 때 가장 효율적이며, 그 결과 돌연변이 빈도가 높다는 것을 보여주는 것이다.

6▲<그림 1b> 전기천공으로 Cpf1 RNPs를 쥐의 50개 배아들에 주입하는 개략도. Image: Hur et al., Nature Biotechnology, 2016

7▲<그림 1c> 표적 사이트에서의 돌연변이를 분석하는 표적 심층 서열 분석. 표적 서열은 빨강색, PAM은 그린색. Cpf1 절단 사이트의 예측은 빨간색 화살표로 표시. ‘-‘는 삭제된 염기들이고 ‘+’는 파랑색으로 표시된 삽입된 염기들로 인델(Indels)의 돌연변이 염기 수치임. Hur et al., Nature Biotechnology, 2016

이번에는 마이크로주입 혹은 전기천공으로 Cpf1 RNP를 마우스 배아들에 주입한 후, 이 배아들을 다시 대리모(surrogate mothers)에 이식하여 새끼들을 낳았는데, 새끼들이 Foxn1 에서 표적 돌연변이(targeted mutations)를 보였다(<그림 1d>). 

8▲<그림 1d> Foxn1 사이트를 표적으로 하는 crRNA를 가진 Cpf1 RNP를 전기천공으로 배아에 주입한 배아 수와 그 결과 돌연변이 수의 요약. (위 줄) 검출된 배아 62개 중, 전기천공으로 Cpf1 RNP가 주입된 배아 수는 49(79%, 49/62), 그 중 배양된 배반포들 수가 25(51%, 25/49), 이 중 16개가 돌연변이 유도됨(64%, 16/25). (아래 줄) 검출된 배아 38개 중, 전기천공으로 Cpf1 RNP가 주입된 배아 수는 30(79%), 이들 30개의 배아를 대리모 이식하여 세끼 7마리가 탄생(23%. 7/30), 7마리 중 3마리가 돌연변이 유도됨(43%, 3/7). NA=Not Applicable. Image: Hur et al., Nature Biotechnology, 2016

특히 Tyr 유전자를 표적으로 대리모 실험 결과, 탄생한 한 마리의 돌연변이 마우스는 모자이크 유전자형(mosaic genotype)과 일치하는 부분적인 외피(털) 색 변화(a partial coat color change)를 보였다(<그림 S8b>).

9▲<그림 S8b> Tyr 돌연변이로 탄생한 한 마리의 쥐의 털은 화살표와 같이 하얀 점(a white spot)이 보였음. Image: Hur et al., Nature Biotechnology, 2016

새끼들의 비-표적 효과(off-target effects)를 조사하기 위해 한 마리의 Foxn1 돌연변이 마우스와 그 야생형 형제(wildtype sibling)에게서 분리된 게놈 DNA를 이용하여 전체 게놈 시퀀싱(whole genome sequencing) 기법으로 분석한 결과, 7-nt까지의 미스매치를 가진 상동 사이트들에서 비-표적 돌연변이는 일어나지 않았다. 

전체 유전체(게놈) 시퀀싱(WGS, Whole Genome Sequencing, Genome-Wide Sequencing): DNA는 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 4종류의 염기로 구성되어 있다. 전체 유전체 시퀀싱은 DNA의 전체 염기서열 순서를 규명하는 기법이다. 참고로 쥐는 20쌍의 염색체에 약 25억개의 염기 쌍을 가진 반면 사람은 23쌍의 염색체에 약 32억개의 염기 쌍으로 구성되어 있다.

 

크기변환_사본-10632695_637493523030856_2757249799481243589_n차원용 소장/교수/MBA/공학박사/미래학자

아스팩미래기술경영연구소(주) 대표, (전)국가과학기술심의회 ICT융합전문위원회 전문위원, 국토교통부 자율주행차 융복합미래포럼 비즈니스분과 위원, 전자정부 민관협력포럼 위원, 국제미래학회 과학기술위원장

 

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