[보고서] ‘3세대 유전자 가위’ 논문·특허기술 전쟁 1

- 크리스퍼/카스(CRISPR/Cas)란 

생명과학자들은 최근 3세대 유전자 가위(크리스퍼/카스, CRISPR/Cas9)를 개발했다. 인간세포와 동식물세포의 유전자를 마음대로 교정 또는 편집하는데(Editing) 사용한다. 표적 DNA를 자른 후 세포 내 복구 시스템에 의해 다시 연결되는 과정에서 유전자 교정과 원하는 변이가 일어난다. 이 방식을 활용해 암과 AIDS 등뿐만 아니라 더 나아가 희귀난치병 치료나 작물•가축개량•미래식량(Clean meat) 분야에서 유전자 가위 혁명이 빠르게 확산되고 있다. 

특정 유전자 부위를 정확하게 잘라 내 그 기능을 알아내는 데에도 사용되고, 쥐를 대상으로 특정 유전자를 제거/억제하거나(Knock-out) 특정 유전자를 삽입하여(Knock-in) 희귀 병을 가진 쥐를 만들기도 하는데, 종전에는 수개월~수년이 걸렸지만 유전자 가위를 이용하면 시간과 비용을 획기적으로 줄일 수 있기 때문이다. 이렇듯 인류는 세포 안에 있는 특정 유전자나 염기를 골라서 제거하거나 정상으로 바꿀 수 있는 유전자 가위 기술을 보유했다. 

본 보고서에서는 3세대 유전자 가위에 대한 논문 공개 순으로 제니퍼 다우드나 교수 팀 – 펭 장 교수 팀 – 김진수 교수 팀의 논문의 내용을 살펴보고, 지금 벌어지고 있는 특허전쟁에 대해서는 특허 출원일 순으로 소개하되, 특허등록 여부를 같이 분석해 인사이트를 제공하고자 한다. 다만, 논문 공개시기보다 대부분 특허 출원일이 앞서 있고, 또한 특허출원서의 내용과 논문 내용이 다룰 수도 있지만, 특허기술들이 논문 연구과정에서 발견한 기술들이라는 점에서 논문을 먼저 살펴보고 특허를 나중에 살펴보기로 한다. 

글 싣는 순서 

I부 – ‘3세대 유전자 가위(CRISPR/Cas9)’ 논문/특허기술 전쟁
1장. 크리스퍼/카스(CRISPR/Cas)란 

2장. 논문 분석
2-1. UCB(버클리대), 제니퍼 다우드나 교수 팀의 논문 분석(2012)
2-2. MIT, 펭 장 교수 팀의 논문 분석(2013)
2-3. 서울대, 김진수 교수 팀의 논문 분석(2013)
3장. 특허분석/특허전쟁
3-1. 다우드나 교수, 원핵생물 대상, 최초 특허출원(2012)과 출원서 공개(2014)
3-2. 김진수 교수(툴젠), 인간세포 대상, 최초 특허출원(2012)과 출원서 공개(2014)
3-3. 장 교수, 인간세포 대상, 초고속 심사 신청, 2014년 4월에 특허를 획득
3-4. 미국 특허심판원 다우드나+장 교수의 양쪽 기술을 모두 인정(2017.02)
3-5. 다우드나 교수의 그간의 노력
3-6. 유럽특허청(EPO), 최초 연구자 다우드나 교수의 특허를 승인(2017.05)
3-7. 중국 국가지식산권국(SIPO), 다우드나 교수의 특허를 승인(2017.06)
3-8. 크리스퍼 논문/특허 분쟁 관련 주요 내용
4장. Discussion
*참고 Genome editing: 유전체 교정인가 편집인가?(23 Jul 2015)

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1장. 크리스퍼/카스(CRISPR/Cas)란 

생명과학자들은 최근 3세대 유전자 가위(크리스퍼/카스, CRISPR/Cas9)를 개발했다. 인간세포와 동식물세포의 유전자를 마음대로 교정 또는 편집하는데(Editing) 사용한다. 표적 DNA를 자른 후 세포 내 복구 시스템에 의해 다시 연결되는 과정에서 유전자 교정과 원하는 변이가 일어난다. 이 방식을 활용해 희귀난치병 치료나 작물•가축개량•미래식량(Clean meat) 분야에서 유전자 가위 혁명이 빠르게 확산되고 있다. 

*유전자 편집(Editing) 
우리말로 조작(Manipulation)이냐, 변형 혹은 수정(Modification)이냐, 편집 혹은 교정(Editing)이냐가 관건인데, 나중에 보시겠지만 제니퍼 다우드나 교수 팀의 논문(2012)이나 펭 장 교수 팀의 논문(2013)이나 김진수 교수 팀의 논문(2013)이나 이를 혼용해서 쓰고 있다는 점이다. 2012~2013년의 논문들이니 혼용을 해서 썼겠지만, 앞으로는 글로벌적으로 합의를 해서 표준 용어를 사용할 필요가 있다. Editing은 번역할 때 발생하는 국내 문제로 영어 용어에는 논란이 되지 않겠지만, 7,000어의 글로벌 언어에서는 향후 나라마다 문제가 될 수도 있다. 그러한 점에서 국내의 표준 용어에 대해서는 2015년 7월 23일에, 김진수 교수를 비롯한 Genome editing 기법을 개발하거나 사용해 학술 논문을 발표한 국내 연구책임자들이 작성한 마지막의 <참고: Genome editing: 유전체 교정인가 편집인가?>을 참조하길 바란다.
 

특정 유전자 부위를 정확하게 잘라 내 그 기능을 알아내는 데에도 사용되고, 쥐를 대상으로 특정 유전자를 제거/억제하거나(Knock-out) 특정 유전자를 삽입하여(Knock-in) 희귀 병을 가진 쥐를 만들기도 하는데, 종전에는 수개월~수년이 걸렸지만 유전자 가위를 이용하면 시간과 비용을 획기적으로 줄일 수 있기 때문이다. 이렇듯 인류는 세포 안에 있는 특정 유전자나 염기를 골라서 제거하거나 정상으로 바꿀 수 있는 유전자 가위 기술을 보유했다. 

크리스퍼는 박테리아의 유전체(게놈)에서 특이하게 반복되는 염기서열(base sequences) 부분으로 '주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(CRISPR, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)'이다. 이와 같은 CRISPRs는 박테리아(세균 포함) 게놈의 약 40%에서, 그리고 고세균(archaea) 게놈의 90%에서 발견된다. 

CRISPR는 DNA이다. 누구의 DNA이냐 하면 바로 천적인 바이러스(Virus, 박테리오파지, Bacteriophage)나 플라스미드(Plasmid)의 DNA이다. 바이러스 크기는 100나노이고 박테리아 크기는 1,000나노이므로 바이러스들은 박테리아를 쉽게 공격한다. 이를 이용한 항생제가 개발되기도 한다. 박테리아들은 침입하는 바이러스들의 DNA 일부를 Cas1(CRIPSR-associated protein 1)과 Cas2 단백질이 협력해 자르고 다듬어(Cleavage and trimming) CRISPR 어레이(Array) 안에 차곡차곡 쌓아둔다. 

*플라스미드(Plasmid)
세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로 주로 고리(원형, circular) 모양이지만 선형(linear)도 있다. 유전공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소(制限酵素)로 끊은 뒤 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세포에 넣어 배양(복제/증식/발현 등)시키는 벡터(vectors, 운반체)로도 자주 사용되고 있다. 여기에 소개되는 논문을 비롯하여 대부분의 논문이 유전자 가위 운반체로 플라스미드를 사용하고 있는데, 플라스미드 자체가 세포의 유전체에 삽입돼 원하지 않는 돌연변이를 일으킬 수도 있다. 따라서 정확한 디자인이 요구된다.

이러한 DNA 일부들은 반복적인 염기서열(repetitive sequences, direct repeats) 사이에 위치하기 때문에 스페이서(사이, Spacer)라고 부르며, 스페이서는 비-반복적인 서열이다. 이렇게 차곡차곡 쌓아두는 과정을 스페이서 획득(spacer acquisition) 또는 스페이서기억(space memory)이라고 한다. 비-반복적인 스페이서 염기서열은 프로토스페이서(원형스페이서)라고 불리는 침입한 바이러스의 일부 염기서열로부터 유도되었다. 

1▲ 스페이서 획득 과정. Cas1과 Cas2 단백질이 협력해 침입하는 바이러스의 DNA를 인식하고 잘라 다듬으면, 그 다음 말단 부착(End joining)이 일어나고, 그 다음 양쪽의 단일 가닥을 오른쪽과 왼쪽으로 확장 시켜(Single strand extension), 맨 앞쪽의 최종 스페이서가 획득된다. 검정색은 반복적으로 나타나는 서열들이고, 스페이서들은 비-반복적으로 나타나는 특정 서열의 다양한 색깔들임. Credit: Wikipedia & Amita & Sorek(2016)

그리고 동일 또는 유사한 바이러스가 침입 할 때 스페이서에 저장해둔 CRISPR DNA 정보를 꺼내 CRISPR RNA(crRNA)로 전사(Transcription)시켜 crRNA를 만든다. 이 과정을 crRNA 프로세싱(processing)이라고 한다. 그 다음 crRNA와 Cas9이 함께 협력하여 침입하는 바이러스의 DNA만을 찾아 잘라(Cleave) 무력화시키는데, 이 과정을 간섭/면역(Interference/Immune)이라 한다. 이렇게 획득(기억)-crRNA 프로세싱-간섭/면역이라는 세 개의 주요 과정을 거치게 도는데, 이는 박테리아가 바이러스로부터 자신을 보호하는 방어 시스템(bacterial defense system) 또는 면역 시스템(immune system)으로, 이들메커니즘을모방해인공(인조) CRISPR/Cas9을 만드는 것이다. 

이 과정을 보다 자세히 살펴보면 다음과 같다. 크리스퍼 어레이에는 그간 침입한 바이러스들의 일부 DNA 염기서열들(base sequences)을 가지고 있는데, 그 크기는 다 다르지만, 전형적인 반복-스페이서 어레이(a repeat-spacer array)에는 대략 21~90 개정도의 염기 쌍들로 이어져 있고, 또한 지금까지 발견된 Cas 유전자들(genes)은 다양한 단백질을 만드는데, 기능적으로 크게 1) 스페이서를 만드는 단백질, 2) 크리스퍼 RNA (crRNA)의 발현에 관여하는 단백질, 3) 목표 유전자를 인식하는 단백질, 4) 목표 유전자를 자르는 단백질 등으로 나눌 수 있다(Makarova et al., 2015).

*Cas 유전자들(genes)
단백질을 만들라는 유전자 암호/코드(Genetic code)인 코돈(Codon)을 가지고 있는 엑손(Exon)의 유전자가 코돈 법칙에 따라 아미노산을 붙여 발현되면 단백질이 된다. 따라서 다음과 같이 표기한다. 유전자의 이름을 칭할 때는 이탤릭 대문자를 사용하고, 유전자가 만드는 단백질을 칭할 때는 대문자를 사용하며, 돌연변이체 이름을 칭할 때는 이탤릭 소문자를 사용한다

 

2▲ 하나의 크리스퍼/카스 좌위(a CRISPR locus)의 간단한 그림. 3가지 구성요소로 이루어져 있는데, 왼쪽에는 Cas 단백질들을 엔코딩한 작은 클러스터(small clusters)의 Cas 유전자들(Cas genes)이 있고, 그 다음 크리스퍼 어레이에는 하나의 선도서열(a leader sequence)과 하나의 반복-스페이서 어레이(a repeat-spacer array)가 있다. 이 세가지 구성요소들은 CRISPR 마다 항상 같지는 않지만 일반적으로 나타나는 요소들이다. 반복들(Repeats)은 회색 박스들(gray boxes)이고 비-반복적인 서열을 가진 스페이서들은 침입한 바이러스들의 DNA를 Cas1과 Cas2가 잘라 차곡차곡 쌓아둔 서로 다른 색깔의 직선 바들(colored bars)이다. Credit: Wikipedia.

스페이서에 있던 바이러스 DNA가 CRISPR RNA(crRNA)로 전사(Transcription)되고, Cas9 유전자가 발현되어 Cas9(CRIPSR-associated protein 9) 단백질이 되어 짝을 이루어 작동하는 것이다. crRNA는 침입하는 표적 바이러스의 특정 염기서열을 찾아내고, Cas9은 염기서열을 절단한다. crRNA는 유도, 즉 가이드(guide RNA, gRNA) 기능을 하고 Cas9는 절단, 즉 무력화 기능을 한다. 이를 3세대 유전자 가위라고 한다. 

3세대인 크리스퍼/카스9이 주목 받는 이유는 이전의 1세대인 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN, Zinc Finger Nuclease,)와 2세대인 탈렌(TALEN, Transcriptional Activator-like Effector Nucleases)에 비해 훨씬 간편하고 값싸고 보다 정확하기 때문이다. 더 나아가 크리스퍼/카스9는 가이드 RNA만 교체해 Cas9 단백질과 함께 세포로 전달하면 되기 때문에 재설계 및 대량생산이 가능하고 원핵생물(prokaryotes)뿐만 아니라 동식물의 진핵세포(eukaryotic cells)에도 자유자재로 사용할 수 있다. 

Cas는 등급(Class)에 따라 1과 2로 나뉘고, Cas의 종류(type)에 따라 I-II-III-IV-V로 나뉘는데, Cas9은 Class 2와 type II에 속한다. 과거에 엔도뉴클레아제(Endonuclease)의 일종인 제한효소(Restriction enzyme)가 유전공학(Genetic engineering)에서 DNA 절단 효소로서의 핵심도구로 사용되었듯이 박테리아(세균 포함)에서 발견된 크리스퍼/카스9 시스템이 유전체(게놈) 공학(Genome engineering)의 핵심도구가 된 것이다. 지난 20세기 유전공학이 과학과 세상을 바꾼 것과 마찬가지로 유전체공학은 21세기 인류 문명의 눈부신 변화와 발전을 가져올 것이다. 그러나 연구를 통한 논문 발표도 중요하지만 더욱 중요한 것은 특허다.

이제 전 세계는 유전자 가위 특허전쟁을 하고 있다. 본보고서에는 특허의 원천이 되는 기본 논문과 기본 논문을 바탕으로 하는 특허기술 관점에서 기술개발 동향과 특허전쟁을 살펴보자.

 

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아스팩미래기술경영연구소(주) 대표, (전)국가과학기술심의회 ICT융합전문위원회 전문위원, 국토교통부 자율주행차 융복합미래포럼 비즈니스분과 위원, 전자정부 민관협력포럼 위원, 국제미래학회 과학기술위원장

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